Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Метод проточной цитометрии позволяет:

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

Флуорохромы [ править | править код ]

Иммунная система человека состоит из большого количества разнообразных клеток. Проточная цитофлуориметрия в иммунологии позволяет оценить их структуру и функции, то есть провести морфофункциональный анализ.

Такие исследования помогают изучить сложную природу иммунитета. Фенотипы клеток меняются в результате активации антигенами, развития патологий и других факторов. Цитофлуориметрия может разделить субпопуляции иммунных клеток в сложной смеси и оценить все их изменения в динамике.

Принцип

Принцип метода проточной цитофлуориметрии основан на измерении рассеивания света и свечения (флуоресценции) клеток. Клеточную суспензию пропускают в виде потока с большой скоростью через ячейку цитометра, где происходит ее облучение лазером. Там же производится, так называемая гидродинамическая фокусировка. Ее механизм заключается в том, что поток из ячейки с изучаемыми частицами на выходе вливается во внешнюю струю, которая обладает большей скоростью. В результате происходит выстраивание частиц в упорядоченную цепочку.

Предварительно клетки метят специальными флуоресцирующими красителями (флуорохромами). Благодаря им лазерный луч возбуждает вторичное свечение. Полученные световые сигналы регистрируются детекторами. В последующем информация обрабатывается при помощи программных алгоритмов, которые позволяют подсчитать отдельные популяции клеток, различающиеся по каким-либо критериям.

Исследование с помощью традиционной микроскопии часто не позволяет отличить разные клетки, так как они одинаково выглядят. Цитофлуориметрия может предоставить и другие данные (целостность структуры ДНК), провести анализ экспрессии белков, выживаемости клеток.

Так как для возбуждения флуорохромов нужны световые лучи с разной длиной волны, а также разные типы детекторов, то современные установки оснащены несколькими каналами детекции (от 4 до 30). Количество лазерных излучателей может быть от 1 до 7. Более сложные по составу устройства позволяют осуществлять многопараметрические исследования сразу нескольких свойств частиц.

Преимущества проточной цитометрии крови и других тканей организма

  1. Возможность анализировать большое число клеток за один подход — вплоть до 108 шт. в мл.
  2. Высокая скорость работы, как следствие — экономия времени. Методом проточной цитометрии можно воспроизводить до 100 000 событий в секунду.
  3. Возможность определять субпопуляции, а также измерять параметры тех клеток, которые редко встречаются.
  4. И наконец, лаборант может изменять интенсивность свечения.

Применение проточной цитометрии

Сегодня это очень востребованный метод клеточного анализа. Он применяется для изучения аспирата костного мозга, крови, ликвора, асцитической, плевральной, суставной жидкостей, тканей (особенно опухолевых), а также суспензии микрочастиц. Применение проточной цитометрии даёт возможность диагностировать онкологические заболевания, позволяет наблюдать за пациентами, находящимися в группе риска, оценивать состояние иммунной системы, выявлять специфические маркёры.

В целом, метод проточной цитометрии используется в разных направлениях медицины, фармакологии и даже сельского хозяйства. Например:

  • Иммунология: обнаружение фагоцитарной активности, внутриклеточных белков, оценка клеточного цикла и цитотоксичности, иммунофенотипирование и т. д.
  • Цитология: исследование клеточного цикла, экспрессии антигенов, определение принадлежности клеток и активности ферментов.
  • Гематология: диагностика лейкозов, резидуальной болезни, лимфопролиферативных болезней, реактивных лимфоцитозов, а также анализ состава клетки, количества ретикулоцитов, тромбоцитов и т. д.
  • Фармакология: определение экспрессии маркёров, активности ферментов, стадий клеточного цикла.
  • Сельское хозяйство: анализ плоидности клеток, цикла, протопластов, а также «сексинг» семенного материала с/х-животных.

Метод успешно используется в трансплантологии и микробиологии. Есть заболевания, при которых цитометрия не рекомендуется: это лимфома Ходжкина, миелодиспластический синдром и миелобластный лейкоз. Вместе с тем, с помощью данной методики врачи могут мониторить терапию и отслеживать состояние пациентов с указанными заболеваниями.

Проточная цитометрия также показала себя эффективной и полезной при беременности.

Сферы применения

Проточная цитофлуориметрия – универсальный метод, который применяется во многих областях медицины и науки:

  • иммунология;
  • онкология;
  • трансплантология (трансплантация красного костного мозга, стволовых клеток);
  • гематология;
  • токсикология;
  • биохимия (измерение кислотности внутри клетки, исследование других параметров);
  • фармакология (создание новых лекарств);
  • микробиология;
  • паразитология и вирусология;
  • океанология (изучение фитопланктона для оценки состояния водоемов и другие задачи);
  • нанотехнологии и анализ микрочастиц.

новая папка / Физические и биологические характеристики клеточной суспензии, выявляемые методом проточной цитометрии. Области применения

Физические и биологические характеристики клеточной суспензии, выявляемые методом проточной цитометрии. Области применения. Проточная цитометрия позволяет охарактеризовать физические и биохимические свой-

ства суспензии клеток в диапазоне их размеров от 0,2 до 150 m.

Преимущества метода проточной цитометрии:

Короткое время анализа (за счет высокой скорости

движения клеток по капилляру, до 1000 клеток/с);Анализ большого количества клеток (до 10 8 клеток); Высокая точность измерения интенсивности флуоресценции и светорассеивания. Образцами являются: костный мозг, ликвор, суставная, плевральная или асцитическая жидкости, а также суспендированные клетки крови и различных тканей. В ходе анализа возможно определять 5-10 различ-ных параметров клетки: размер, содержание ДНК, белков (цитокинов, транскрипционных факоров) и липидов, антигенные свойства и активность фермен-тов, а также возможны исследование клеточного цикла, мониторинг состояния вирусного процесса, количественный анализ внутриклеточных компонен-тов и количественные измерения путем дифференци-ровки интенсивности рассеяния / флуоресценции при различных длинах волн.

Проточная цитометрия — ведущий метод в клинической иммунологии и гематологии. Метод используют для решения следующих задач:

иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества CD4, CD8 клеток и даже ТН1 и ТН2 (по продукции специфических цитокинов); анализа процессов клеточной активации на основе определения маркеров ранней активации: CD25 (рецептор интерлейкина-2), СD38, CD69, CD71 (трансферриновый рецептор), CD95 (антиген апоптоза), CD122, анти-HLA-DR;

определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3); оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями;

иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом; анализа клеточного цикла с определением распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия); анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95L, Bcl-2, P53).

Области применения: Иммунология

Иммунофенотипирование клеток крови; определение фагоцитарной активности; определение внутриклеточных цитокинов и различных внутриклеточных белков (например, транскрипционных факторов); определение пролиферативной активности; исследование клеточного цикла; оценка клеточной цитотоксичности; трансплантационный мониторинг.

Количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК); Анализ стадий клеточного цикла; Определение специфических маркеров; Наблюдать пациентов, входящих в группу риска; Оценка состояния иммунной системы; Оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов); Оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т.п.).

Определение цитоморфологических характеристик клетки: размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток; Оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов; Определение экспрессии поверхностных антигенов; Анализ стадий клеточного цикла; Измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация ионов Ca 2+ ,

потенциал клеточной мембраны).

Анализ субпопуляционного состава клеток крови; Подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам; Диагностика и дифференциальная диагностика

лимфопролиферативных заболеваний; Диагностика острых лейкозов.

Клеточная биология, биохимия

Измерение экспрессии маркеров; Измерение активности внутриклеточных ферментов; Определений стадий клеточного цикла при изучении механизмов действия БАВ на клеточном уровне. Заключение:

Проточная цитометрия в её современных вариантах — мультипараметрический анализ. Это позволяет минимизировать необходимый объем биологического материала (до 100 мкл), сни-зить время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым, путь от получения образца до клинической интерпретации результата – ответа лаборатории клинике. Разнообразие вариантов использования проточной цитометрии на сегодняшний день может быть ограничено только фантазией исследователя, а в диагностической службе – аналитическими потребностями клиники.

Проточная цитометрия. Принципы, использование в иммунологической и гематологической практике.

Проточная цитометрия (ПЦ) представляет собой технику для быстрого оптического анализа отдельно взятых клеток. Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Это метод, в основу которого положено измерение характеристик клеток, их состовляющих, а также последующего физического отделения интересующей субпопупяции клеток или микрочастиц на основании анализа измеренных характеристик.

Уникальной особенностью многих клеток и частиц является их способность флуоресцировать. Проточная цитометрия основана на принципах возбуждения светом и эмиссии флуорохромных молекул. При помощи этого метода можно получать информацию о частицах и клетках размером от 0.5 до 4.0 мкм. Через проточные цитометры проходят гидродинамически сконцентрированные клетки, на которые воздействует источник света. В качестве источника света наиболее часто используют лазеры.

Как только на клетки или частицы попадает луч света, флуорохромы переходят на более высокий энергетический уровень. А возврат в исходное состояние происходит при помощи отдачи энергии в виде кванта света. Квант каждого флуорохрома имеет соответствующую длину волны. Испускаемый клетками и частицами свет регистрируется оптическими детекторами. Самым используемым в проточной цитометрии детектором является PMT (photomultiplier tube). Электрические импульсы, порождаемые световыми детекторами PMT-сенсоров, затем обрабатываются линейными и лаг-усилителями. Логарифмическое усиление наиболее часто используется для измерения флуоресцентной способности клеток. Этот тип усиления позволяет усилить слабые сигналы. После усиления сигналов и пульсов производится их обработка с помощью ADC (Analog to Digital Converter), который выводит конечный результат в виде гистограмм.

Методика обладает целым рядом преимуществ перед традиционной цитометрией, в числе которых:

· возможность исследования в ходе одного анализа значительно большего числа клеток (более 100000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток), что позволяет получать статистически достоверные результаты и выявлять редкие типы клеток;

· возможность проведения количественных измерений путем дифференцировки интенсивности рассеяния/флуоресценции при различных длинах волн;

· возможность одновременного исследования различных характеристик и структурных компонентов одной клетки.

Типичный аппарат для проведения проточной цитометрии позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, содержание белков, ДНК, липидов, антигенные свойства, активность ферментов и т.п. Кроме того, исследование отдельно взятых клеток даёт возможность выявить и оценить степень гетерогенности популяции, что не всегда может быть достигнуто другими методами.

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100-1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом (наиболее часто изотиоцианат).

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т.п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Таким образом, проточная цитометрия обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами микробиологических исследований. Появление в последние годы в свободной продаже специальных наборов для выявления целого ряда микроорганизмов позволило значительно расширить диагностические возможности проточной цитометрии. Тем не менее, вопрос стандартизации метода и адекватной интерпретации его результатов остаётся актуальным до сих пор.

71. Исследование пунктата костного мозга: подготовка материала, подсчет миелограммы, интерпретация результатов.

В клинической практике используются два метода исследования КМ: 1) Цитологическое исследование пунктата КМ; 2) гистологическое исследование (трепанобиопсия). Чаще используется цитологическое исследование. Пункцию КМ проводят в процедурном кабинете с соблюдением правил асептики, используют иглу Кассирского с предохранительным щитком-ограничителем и шприц 10-20 мл. Игла и шприц должны быть стерильны и высушены спиртом и эфиром. у взрослых пунктируют чаще грудину (рукоятку или на уровне 3-4 межреберья) по средней линии. Можно пунктировать подвздошную кость, ребра. У детей чаще пунктируют под­вздошную кость, пяточную, нижний эпифиз бедренной кости, грудину. Иглу вводят быстрым движением в костно-мозговой канал, после извлечения мандрена на иглу насаживают шприц и аспи­рируют КМ. Во избежание большой примеси крови к костному мозгу в шприц необходимо набрать материала как можно меньше (несколько капель, 0,1-0,3 мл). После взятия КМ иглу, не разъединяя со шприцем, извлекают из грудины, а место прокола закрывают стерильной наклейкой. Полученный материал переносят на стекло с луночкой или часовое стекло. Пунктат слегка перемешивают стеклянной палочкой. Учитывая быструю коагуляцию пунктата, все дальнейшие манипуляции делают быстро. Из капель пунктата готовят тонкие мазки обычным образом. Производят забор пунктата для подсче­та количества мегакариоцитов и миелокариоцитов в 1 л.

Требования к мазкам КМ, их фиксация и окраска аналогичны таковым к мазкам крови. Готовят как можно больше мазков (не менее 10). Подсчет мегакариоцитов. Подсчет количества мегакариоцитов осуществляют в счетной камере (по всей камере). В 1 мкл пунктата количество клеток равно: количество клеток в камере × 20 (разведение) / 3,2 (объем камеры). Окончательный расчет после сокращения: количество клеток в камере × 6,2. Норма. У взрослых в 1 мкл пунктата КМ содер­жится 30−80 мегакариоцитов. У детей в возрасте от 5 мес до 3,5 го­да − 116 ± 10,8. Увеличение количества мегакариоцитов наблюдается при тромбоцитопенической пурпуре (подавляющая часть клеток не функционирует), ХМЛ, сублейкемическом миелозе, эритремии, после кровопотери, при злокачественных новообразованиях, циррозе печени. Уменьшение количества — при ОЛ, терминаль­ной стадии хронических лейкозов, гипо- и апластических ане­миях, лучевой болезни, мегалобластных анемиях, гиперспленизме.

Подсчет миелокариоцитов (костно-мозговых ядросодержащих клеток) в 1 л пунктата костного мозга (аналогично подсчету числа лейкоцитов в крови). Рассчитывают кол-во миелокариоцитов в 1 мкл пунктата по обычной для подсчета лейкоцитов формуле с учетом большего разведения (количество ядросодержащих клеток в 100 больших квадратах умножают на 500, или полученное число делят на два и прибавляют три нуля). Пример. В 100 больших квадратах подсчитано 120 клеток. Кол-во миелокариоцитов в 1 мкл равно (120:2) × 1000 = 000. Для перевода в единицы СИ полученную цифру умножа­ют на 10 6 . Тогда 60 000 × 10 6 = 60,0 х 10 9 /л. Норма: 41,6−195,0 × 10 9 /л. Количество миелокариоцитов дает представление о клеточ­ности КМ. Увеличение числа ядросодержащих клеток характерно для ХМЛ, эритремии, ОЛ, гемолитической анемии, мегалобластной анемии, постгеморрагической анемии. Уменьшение количества − для гипо- и апластических анемий, анулоцитоза, лучевой болезни, после цитостатической терапии. Цитологическое исследование костного мозга с подсчетом миелограммы. Фиксируют и окрашивают обычными гематологическими методами 3-5 мазков, остальные приготовленные мазки должны оста­ться в запасе. Очень важно, чтобы мазки КМ были правильно приготовлены и окрашены. Все окрашенные препараты вначале внимательно просматривают под малым увеличением (окуляр 7, объектив 10) для ориентировочного представления о клеточности КМ, наличии и числе мегакариоцитов, обнаружения комплексов опухолевых клеток, скоплений миеломных клеток, клеток Березовского — Штернберга, клеток Гоше и др. В случае выявления патологических элементов на препарат наносят кaплю масла, микроскоп переводят на большое увеличение (окуляр 7, объектив 90) и изучают морфологию этих элементов, оценивают функциональную активность мегакариоцитов. К функционирующим (деятельным) относят те мегакариоциты, рядом с цитоплазмой, которых располагаются отделенные от нее тромбоциты и/или в цитоплазме имеется обильная зернистость, местами собран­ная в скопления, напоминающие тромбоциты. В норме 60−70% мегакариоцитов отделяют тромбоциты.

После просмотра мазков под малым увеличением приступают дифференцировке форменных элементов − подсчету миело­граммы. Миелограмма − процентное содержание различных клеток КМ. Для подсчета миелограммы в разных тонких участках 3−5 мазков дифференцируют не менее 500 (лучше 1000) миелокарио­цитов. Подсчитывают все встречающиеся в поле зрения элементы.

После подсчета 500 клеток делят число клеток каждого вида на 5 (при подсчете 1000 клеток − на 10) и выдают ответ в процентах. При оценке пунктатов КМ, кроме процентного содержания клеточных элементов, учитывают соотношение раз­личных групп клеток − рассчитывают костномозговые индексы.

1. Лейко-эритробластическое отношение (Л/Э, Л:Э) − отно­шение суммы клеток лейкоцитарного ряда к сумме клеток эритроцитарного ряда:

Миелобласты + промиелоциты + нейтрофилы + базофилы + моноциты + лимфоциты / эритробласты + базофильные нормобласты + полихроматофильные нормобласты + оксифильные нормобласты. В норме Л/Э равно 2,1/1 − 4,5/1.

2. Костно-мозговой индекс нейтрофилов учитывает соотношение молодых и более зрелых форм нейтрофилов: Промиелоциты + миелоциты + метамиелоциты / Палочкоядерные + сегментоядерные. Норма: 0,5−0,9.

3. Индекс созревания эритрокариоцитов — отношение гемоглобинсодержащих нормобластов ко всем клеткам эритроцитарного ряда: Полихроматофильные нормобласты + оксифильные нормобласты / Эритробласты + базофильные нормобласты + полихроматофильные нормобла­сты + оксифильные нормобласты. Норма: 0,7−0,9.

В описательной части миелограммы указывают кол-во ядросодержащих клеток в препаратах; количество мегакариоци­тов (умеренное, в большом количестве, встречаются редко, не найдены), их функциональную активность; наличие атипичных клеток; клеточных скоплений; дегенеративные изменения клеток. При оценке миелограммы важно сопоставить картину кост­ного мозга с картиной периферической крови. В некоторых слу­чаях для уточнения диагноза прибегают к трепанобиопсии.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Визуализирующие цитометры

Для приборов, использующихся в классической проточной цитофлуориметрии, характерна одна особенность: если в популяции анализируемых клеток зарегистрированы редкие события, то нет возможности оценить, какова их суть. Эти частицы могут оказаться как останками умерших клеток, так и их редкой группой. В обычных аппаратах такие данные исключаются из общего потока событий, однако именно они могут представлять особую ценность для научного и клинического анализа.

Визуализирующие проточные цитометры нового поколения позволяют зафиксировать изображение каждой клетки, проходящей в потоке через зону детектора. Его легко увидеть, нажав на соответствующую область диаграммы, которая выводится на монитор компьютера.

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ — ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА И ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.

Иммунология

Иммунная система человека состоит из большого количества разнообразных клеток. Проточная цитофлуориметрия в иммунологии позволяет оценить их структуру и функции, то есть провести морфофункциональный анализ.

Такие исследования помогают изучить сложную природу иммунитета. Фенотипы клеток меняются в результате активации антигенами, развития патологий и других факторов. Цитофлуориметрия может разделить субпопуляции иммунных клеток в сложной смеси и оценить все их изменения в динамике.

Онкология

Одной из важнейших задач в онкологии является дифференцирование клеток по их типу. Принцип анализа по методу проточной цитофлуориметрии в онкогематологии основан на следующем явлении: при обработке пробы специальным флуоресцентным красителем происходит его связывание с белками цитоплазмы. После деления в активно пролиферирующих клетках происходит снижение его содержания в два раза. Соответственно, двукратно уменьшается и интенсивность свечения клеток.

Существуют и другие способы выявления пролиферирующих клеток:

  • использование ДНК-связывающих красителей (йодид пропидия);
  • применение меченого урацила;
  • регистрирование повышенного уровня экспресии белков циклинов, которые участвуют в регуляции клеточного цикла.

Преимущества и недостатки

К преимуществам проточной цитофлуориметрии относятся следующие:

  • высокая скорость обработки (регистрация до 30 тысяч событий за 1 секунду);
  • возможность исследования большого числа клеток (до 100 млн. в образце);
  • количественная оценка интенсивности флуоресцентного излучения;
  • анализ каждой из клеток;
  • одновременное исследование разнородных процессов;
  • автоматическое разделение данных по популяциям клеток;
  • качественная визуализация результатов.

Еще одной особенностью этой технологии является то, что анализируемую частицу допускается окрашивать несколькими флуоресцентными растворами. Благодаря этому происходит многопараметрическое исследование.

К недостаткам можно отнести сложность технического оборудования и необходимость специальной подготовки пробы.

Принципы метода проточной цитометрии

Клеточную суспензию метят флуоресцентными красителями, после чего вместе с потоком жидкости пропускают через проточную ячейку. Клетки вынуждены «выстраиваться» друг за другом, благодаря чему становится возможным брать исследовать конкретную.

После отделения клетка облучается лазером, а затем сигналы рассеивания/свечения регистрируются на специальном аппарате.

Размер клетки определяется за счёт рассеивания света под углом до 10°, размеры ядра и цитоплазмы — за счёт рассеивания под углом до 90°. Также учитывается интенсивность флуоресцентного свечения по 30 каналам. Глядя на эти показатели, лаборант определяет, из чего состоит клетка.

Принцип метода проточной цитометрии в клинической лабораторной диагностике

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Метод проточной цитометрии позволяет:

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

Цитометры

Первые устройства такого типа появились уже в 1968 году в Германии, но широкое распространение они получили гораздо позднее. В настоящее время все приборы, работающие по методу проточной цитофлуориметрии, можно разделить на 2 типа:

  • устройства, что измеряют флуоресцентное излучение (две и более длины волны), рассеяние света под углом 10 и 90° (детектор малоуглового и бокового рассеяния);
  • аппараты, которые, помимо измерения нескольких клеточных параметров, автоматически производят сортировку на группы в соответствии с этими критериями.

Детектор прямого светорассеяния предназначен для определения размеров клетки, а устройство для регистрации бокового светорассеяния позволяет получить информацию о наличии внутриклеточных гранул, объемного соотношения цитоплазмы и ядра.

Классические цитометры, в отличие от световых микроскопов, не позволяют получить изображение клетки. Однако в последние годы разработаны комбинированные устройства, которые способны совмещать возможности микроскопа и цитофлуориметра. Речь о них пойдет ниже.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Принцип [ править | править код ]

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Метод проточной цитометрии позволяет:

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

Проточная цитометрия. Принципы, использование в иммунологической и гематологической практике

Проточная цитометрия (ПЦ) представляет собой технику для быстрого оптического анализа отдельно взятых клеток. Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Это метод, в основу которого положено измерение характеристик клеток, их состовляющих, а также последующего физического отделения интересующей субпопупяции клеток или микрочастиц на основании анализа измеренных характеристик.

Уникальной особенностью многих клеток и частиц является их способность флуоресцировать. Проточная цитометрия основана на принципах возбуждения светом и эмиссии флуорохромных молекул. При помощи этого метода можно получать информацию о частицах и клетках размером от 0.5 до 4.0 мкм. Через проточные цитометры проходят гидродинамически сконцентрированные клетки, на которые воздействует источник света. В качестве источника света наиболее часто используют лазеры.

Как только на клетки или частицы попадает луч света, флуорохромы переходят на более высокий энергетический уровень. А возврат в исходное состояние происходит при помощи отдачи энергии в виде кванта света. Квант каждого флуорохрома имеет соответствующую длину волны. Испускаемый клетками и частицами свет регистрируется оптическими детекторами. Самым используемым в проточной цитометрии детектором является PMT (photomultiplier tube). Электрические импульсы, порождаемые световыми детекторами PMT-сенсоров, затем обрабатываются линейными и лаг-усилителями. Логарифмическое усиление наиболее часто используется для измерения флуоресцентной способности клеток. Этот тип усиления позволяет усилить слабые сигналы. После усиления сигналов и пульсов производится их обработка с помощью ADC (Analog to Digital Converter), который выводит конечный результат в виде гистограмм.

Методика обладает целым рядом преимуществ перед традиционной цитометрией, в числе которых:

· возможность исследования в ходе одного анализа значительно большего числа клеток (более 100000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток), что позволяет получать статистически достоверные результаты и выявлять редкие типы клеток;

· возможность проведения количественных измерений путем дифференцировки интенсивности рассеяния/флуоресценции при различных длинах волн;

· возможность одновременного исследования различных характеристик и структурных компонентов одной клетки.

Типичный аппарат для проведения проточной цитометрии позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, содержание белков, ДНК, липидов, антигенные свойства, активность ферментов и т.п. Кроме того, исследование отдельно взятых клеток даёт возможность выявить и оценить степень гетерогенности популяции, что не всегда может быть достигнуто другими методами.

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100-1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом (наиболее часто изотиоцианат).

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т.п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Таким образом, проточная цитометрия обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами микробиологических исследований. Появление в последние годы в свободной продаже специальных наборов для выявления целого ряда микроорганизмов позволило значительно расширить диагностические возможности проточной цитометрии. Тем не менее, вопрос стандартизации метода и адекватной интерпретации его результатов остаётся актуальным до сих пор.

Дата добавления: 2015-04-19 ; просмотров: 1241 . Нарушение авторских прав

Применение метода проточной цитометрии

Рис. 2.6.Проточный цитофлуориметр

Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью, высоким уровнем автоматизации, просты в эксплуатации, имеют небольшие размеры (рис. 2.6, см. также цв. вклейку). Проточная цитометрия стала незаменимым методом диагностики различных иммунопатологических состояний в клинической практике: успешно используется в гематологических лабораториях, для оценки иммунного статуса, в онкологии. Метод позволяет:

• проводить иммунофенотипирование клеток: дифференцировать популяции лейкоцитов, определять субпопуляционный состав лимфоцитов;

• оценивать функциональную активность клеток;

• проводить анализ клеточного цикла и плоидности клеток;

• проводить анализ программируемой клеточной гибели (апоптоза);

• определять внутриклеточные и растворимые формы цитокинов;

• оценивать фагоцитарную активность клеток;

• проводить анализ биологических жидкостей (секреты, слюна и др.);

• проводить количественное и качественное исследование pH, концентрации свободных ионов кальция, уровня окислительных процессов;

• осуществлять мониторинг иммунодефицитных состояний, проводить онкогематологические исследования.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 9122 — | 7353 — или читать все.

Проточная цитофлуориметрия — сущность и применение

Проточная цитофлуориметрия – это цитологический метод исследований, применяющийся для углубленного анализа клеток. Его преимуществом является то, что он позволяет изучить каждую клетку в отдельности. Данный вид анализа помогает произвести оценку нескольких параметров у сотен клеток за считанные секунды. Благодаря этому цитофлуориметрия считается одним из наиболее быстрых и точных способов анализа, которые доступны ученым и клиницистам в настоящее время.

Артем Демидов
Российский врач, врач-кардиолог, врач общей практики, телеведущий, радиоведущий, автор книг о здоровье.
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
FreeLifeClinic.ru